辅仁大学是1925年罗马教廷天主教会所创办，前身是北京公教大学附属辅仁社，后罗马教廷委派美国本笃会承办。全美本笃会大会决议，委派美国圣文森院院长司泰来负责。后司泰来委派本笃会教士奥图尔（Otooled）来中国筹办，并做未来之校长。1927年更名为北京辅仁大学，曾与北大、清华、燕京并称北平四大名校，是一所由罗马公教创办的天主教大学。

北京西城区定阜街1号为辅仁大学旧址所在处，校址原为涛贝勒府，如今此地为澳门永利唯一官网304辅仁校园。1925年3月，以16万元租金永租李广桥西街十号旧涛贝勒府（现在为北京第十三中学）作为校址，共计六十四亩。1930年，因原有校舍不敷使用，在旧涛贝勒府花园西旁空地（原学校西边）增建一座二层楼，四角及中心分为三层。共有房间五百余间，设置办公室、图书馆、实验室、教室等。同时兼有可容纳一千多人的大礼堂。大学迁入新校后，原校址供附中使用。同时大学开辟新门，为定阜大街1号。再后来在今兴华胡同租住、新建宿舍并操场，这基本是1952年院校合并时的辅仁大学风貌。后院校合并，该校舍成为澳门永利唯一官网304化学系所在地。

日本占领时期辅仁大学是唯一被国民党政府承认的在京大学。由于中日战争的发生，各大学纷纷迁往内地，辅仁大学因创办者美国本笃会被美德两国圣言会接替，以及其他原因，一直未被日伪接管，也因此成为沦陷区当时的国民政府唯一承认的大学。当时的大学教师一部分迁往内地；也有少量因故不能内迁，又不愿意在日伪管辖的大学任教，纷纷转入辅仁大学。许多青年得知辅仁大学是国民政府唯一承认的学校，基于爱国思想，不甘心去读日伪控制的大学，又一时不能离开沦陷区，纷纷投考辅仁大学。由于辅仁大学每年所录取人数有限，导致入学考试竞争很大，学校业务水平也日益提高，这段时间是辅仁大学的鼎盛时期，学校发展迅速。

辅仁大学开始时只设文科专业。至1929年，按照当时教育部条例，大学必须有3个以上学院。辅仁大学增设理学院和教育学院，将原来的文科各系改为文学院，合为3个学院，共12个系，其中理学院包含数学系、物理系、化学系、药学系和生物系。